|
|
Discovery of General Controů Nondereprssible 5 protein interactors using proximity labeling
Potapenkova, Uliana
Proteiny obvykle nepůsobí jako samostatné jednotky, ale plní svou funkci v komplexech s jinými proteiny. Identifikace protein-proteinových interakcí (PPI) přináší vhled do regulace vývojových procesů rostlin a jejich reakcí na podmínky prostředí. V posledních letech bylo vyvinuto několik metod pro studium PPI, jelikož představují klíčové cíle výzkumu biologie rostlinného systému. Tato práce je zaměřena na metodu Proximity Labeling (PL) a to za účelem studia proteinových interaktorů GCN5. GCN5 je histonacetyltransferáza, která hraje klíčovou roli v obranných reakcích rostlin na různé abiotické stresy. Studie jeho interaktorů poskytují cenné informace o mechanismech acetylace histonů a způsobu, jakým se rostliny vyrovnávají s nepříznivými podmínkami. Zde jsou shrnuty výhody a nevýhody PL metody a ta je porovnána s jinými metodami studií PPI. Experimentální část téhle práce byla zaměřena na klonování GCN5 a přípravu plazmidu pro budoucí proximitní značení na bázi biotinu.
|
|
|
Interakce proteinových podjednotek SEC10 a SEC15 poutacího komplexu exocyst
Bartáková, Anna ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
Exocyst je evolučně konzervovaný poutací komplex zapojený do regulace sekreční dráhy v eukaryotických buňkách. Jakožto efektor malých GTPáz zásadně přispívá ke správnému cílení sekrečních váčků do místa intenzivní exocytózy na plazmatické membráně díky interakci se specifickými fosfolipidy. Komplex exocyst se skládá z osmi podjednotek: SEC3, SEC5, SEC6, SEC8, SEC10, SEC15, EXO70 a EXO84, přičemž každá podjednotka se váže s minimálně dvěma dalšími podjednotkami. Pro funkci exocystu je klíčová interakce SEC10 a SEC15. Otázkou zůstává, jak jsou tyto dvě podjednotky v rámci rostlin funkčně konzervované. Geny SEC10 a SEC15 ze zástupců tří evolučně rozdílných skupin rostlin (zelené řasy - Klebsormidium nitens, mechu - Marchantia polymorpha, krytosemenné - Arabidopsis thaliana) byly klonovány do vektorů kvasinkového dvouhybridního systému pro studium proteinových interakcí. Testování vzájemné interakce SEC10 a SEC15 z odlišných druhů rostlin v kvasinkovém dvouhybridním systému ukázalo, že i přes variabilitu v proteinových sekvencích těchto podjednotek, zůstává jejich interakce napříč evolučními skupinami rostlin velmi dobře zachována.
|
|
|
Characterization of Cbf11 and Mga2 interactions in the fission yeast
Grulyová, Michaela ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Transkripční faktor Cbf11 patří do CSL proteinové rodiny. CSL proteinová rodina je známá pro svou funkci v Notch signální dráze, avšak zástupci CSL proteinové rodiny byli objeveni i v poltivé kvasince postrádající dráhu Notch. Protein Mga2 je transkripční regulátor metabolismu triacylglycerolů a glycerofosfolipidů. Bylo nalezeno propojení mezi Cbf11 a Mga2. Cbf11 a Mga2 sdílejí cílové geny a jsou potřební pro přesnost mitózy. Tato diplomová práce se snaží validovat a charakterizovat vztah mezi těmito transkripčními regulátory. Ukazujeme zde, že hladina proteinů Cbf11 a Mga2 se mění v závislosti na přítomnosti toho druhého proteinu a také v závislosti na zdroji dusíku. Také zde uvádíme fylogenetickou distribuci Cbf11 a Mga2 v rámci říše Fungi a ukazujeme, že je zde propojení. Za použití proteomické analýzy mga2 a cbf11 delečních kmenů jsme našli překryv mezi proteiny up a downregulovanými. Dohromady tyto výsledky potvrzují crosstalk mezi proteiny Cbf11 a Mga2 a přinášejí nové spojení mezi CSL proteinovou rodinou a funkčním analogem savčího SREBP1, proteinem Mga2.
|
|
|
Characterization of protein-protein interactions between Forkhead box O (FOXO) and p53 transcription factors
Mandal, Raju ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Transkripční faktor p53 hraje klíčovou roli v regulaci buněčného cyklu, opravě DNA, apoptóze, obraně před nádorovými onemocněními a udržování buněčné homeostázy. Při buněčném stresu p53 přímo interaguje s transkripčním faktorem Forkhead box O (FOXO) 4, čímž zvyšuje expresi proteinu p21, což vede k indukci buněčné senescence. Molekulární mechanismus interakce těchto dvou klíčových transkripčních faktorů však zůstává nejasný kvůli absenci strukturních dat. Hlavním cílem této dizertační práce byla strukturní charakterizace interakce mezi FOXO4 a p53 prostřednictvím několika biofyzikálních technik včetně metody sedimentační rychlosti analytické ultracentrifugace (SV AUC), nukleární magnetické rezonance (NMR), chemického zesítění spojeného s hmotnostní spektrometrií. Dále byla studována DNA vazebná afinita obou proteinů k jejich příslušným konsenzuálním DNA sekvencím v přítomnosti nebo nepřítomnosti jejich vazebných partnerů a byl porovnán p53-vazebný povrch Forkhead domény tří různých FOXO proteinů. Připravené proteiny byly také použity pro optimalizaci nízkomolekulárních sloučenin umožňujících inhibici interakce mezi FOXO3 a DNA. Získané výsledky ukázaly, že p53 interaguje s FOXO4 prostřednictvím komplexních přechodných interakcí zahrnujících strukturované i neuspořádané oblasti obou proteinů. NMR...
|
|
|
Fyzické interakce sestřihového faktoru Prp45
Kratochvílová, Eliška ; Folk, Petr (vedoucí práce) ; Doubravská, Lenka (oponent)
Je známo, že posttranslační stav chromatinu, transkripce a sestřih se vzájemně ovlivňují, přesto ve studiu jejich vztahů zbývá ještě mnoho nezodpovězených otázek. V kvasince Saccharomyces cerevisiae lze relativně snadno navodit stavy, kdy je v životaschopných buňkách sestřih oddělen od transkripce. Takového stavu bylo docíleno mutací sestřihového faktoru Prp45, jehož savčí homolog se prokazatelně účastní jak regulace transkripce, tak sestřihových reakcí. Na základě předem indikovaných interakcí v dvouhybridním systému byla v této práci hledána fyzická spojení proteinu Prp45 s proteiny účastnícími se posttranslačních modifikací chromatinu. Jejich nalezení by poskytlo vhled do vzájemných vztahů procesů genové exprese. Koimunoprecipitací ani afinitní purifikací nebyly nalezeny fyzické interakce mezi proteinem Prp45 a námi zvolenými regulátory chromatinu. O alternativních přístupech uvažujeme. Koprecipitačními metodami byla dále blíže lokalizována interakce proteinu Prp46 se zkrácenými variantami proteinu Prp45. Toto pozorování rozšířilo naše znalosti o protein- proteinových interakcích v rámci sestřihového komplexu.
|
|
|
Modelování interakcí cytochromů P450 s flavodoxinem
Culka, Martin ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Cytochromy P450 jsou různorodá skupina hemových enzymů vyskytujících se u vět- šiny organismů na Zemi. U lidí zasahují např. do metabolismu cizorodých látek, bakterie jsou schopné díky nim metabolizovat různé hydrofobní substráty. Obecnou reakcí kata- lyzovanou cytochromy P450 je monooxygenace, tedy vnesení jednoho atomu z molekuly kyslíku do substrátu a redukce druhého za vzniku vody. Pro redukci kyslíku je třeba dodávat elektrony, jako donor elektronů u eukaryot obvykle slouží NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasa či cytochrom b5, u bakterií však donorem elektronů bývají malé FeS proteiny a flavoproteiny Již dříve bylo ukázáno, že bakteriální donor elektronů fla- vodoxin je schopen dodávat elektrony některým lidským cytochromům P450 in vitro. V této práci jsem se snažil ověřit hypotézu, že flavodoxin je zodpovědný za redukci vybraných lidských (1A2, 2A6, 2A13, 2C9, 2C19, 3A4) a bakteriálních (101A1 a 176A1) cytochromů P450 heterologně exprimovaných v buňkách Escherichia coli. Ke studiu byly použity techniky molekulového modelování. Byla navržena sada možných orientací komplexu jednotlivých cytochromů P450 s flavodoxinem metodou řízeného "dockingu a následně byla ověřena stabilita těchto komplexů řízenou disociací. Byly vybrány nejstabilnější orientace pro každý cytochrom P450, ty byly dále optimalizovány...
|
|
|
Využití metody predikce protein-protein interakčních míst pro detekci falešných krystalografických kontaktů
Mitková, Natália ; Hoksza, David (vedoucí práce) ; Jakubec, Dávid (oponent)
Jedným zo zásadných problémov pri získavaní kvartérnej štruktúry proteínov je rozlíšenie biologických kontaktov od falošných rozhraní, ktoré sú artefaktom kryštalizácie proteínu predchádzajúcej samotnému určeniu terciárnej a kvartérnej štruktúry. Získanie znalostí o interakcii proteínov v 3D priestore je kľúčové pre pochopenie ich funkcií a ponúka sa možnosť tieto znalosti využiť pri analýze vplyvu inhibítorov, návrhu liekov, imunoterapii alebo návrhu nových proteínov. Taktiež je táto informácia nevyhnutnou požiadavkou pri aplikácii in silico prístupov. Bakalárska práca je rozdelená na dve časti. V prvej časti sa nachádza rešerš existujúcich metód riešiacich problém detekcie kryštalografických kontaktov spoločne s príslušnými datasetmi pre objektívne vyhodnotenie schopností riešiť túto problematiku. Druhá praktická časť je zameraná na porovnanie vyhodnotenia schopností už skôr vyvinutej metódy na rozlíšenie proteín-proteín interakčných miest INSPiRE a klasifikátora EPPIC. Kľúčové slová: bioinformatika, kryštalografický kontakt, kryštalizácia, proteínová štruktúra, proteín-proteín interakcia
|
|
|
Applications of graph theory in protein function prediction
Kalábová, Nikola ; Hartman, David (vedoucí práce) ; Kratochvíl, Miroslav (oponent)
Rapidní vývoj celogenomových sekvenačních metod a jejich snižující se cena za- příčinila existenci velkého množství osekvenovaných genomů. Vývoj spolehlivých in-silico metod pro anotaci rychle rostoucího počtu osekvenovaných genomů představuje výzvu pro moderní biologii. V práci představujeme způsob predikce funkce proteinů, založený na aplikaci teorie grafů v protein-protein interakčních sítích a identifikujeme jeho silné a slabé stránky. Tento přístup poté ilustrujeme na vybraných algoritmech založených na různých myšlenkách. Představené algoritmy porovnáváme a vyhodnocujeme jejich spolehlivost. 1
|
|
|
Interakce hlavního kapsidového proteinu polyomavirů s jadernými laminy
Žáčková, Sandra ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Tato práce se soustředí na studium interakcí virových strukturních proteinů myšího polyomaviru (MPyV) a BK viru se strukturou jaderné laminy. Cílem bylo objasnit, zda a případně jakým způsobem virus, potažmo virové strukturní proteiny, interagují s jadernou laminou a jak tyto interakce ovlivňují její vlastnosti. Předpokládali jsme, že exprese virových proteinů bude indukovat rozrušení struktury jaderné laminy, které následně umožní únik virionů z jádra v závěrečné fázi infekce. Strukturní proteiny MPyV byly exprimovány z expresního vektoru pMPyV LATE, který zajistil lokalizaci virového proteinu VP1 podobnou jako u infikovaných buněk - převážně v perinukleárních oblastech jádra. Zároveň v těchto buňkách byly nalezeny defekty v barvení jaderné laminy indikující její narušení tak, jak je tomu v buňkách infikovaných MPyV. Pro experimenty jsme používali ještě expresní vektor pMPyV mut3 VP1 kódující mutovaný protein VP1. Při transientní expresi v buňkách vykazoval mutovaný protein VP1 sice difúzní jadernou lokalizaci, ale pozorovali jsme výrazné deformace a poruchy barvení jaderné laminy, které naznačují významnou roli proteinu VP1 ve změnách vlastností jaderné laminy v infikovaných a transfekovaných buňkách. Zjistili jsme, že největší množství proteinu VP1 v buňkách po transfekci pMPyV LATE a v pozdní...
|
|
|
Cílená mutageneze ve studiu lidských cytochromů P450 rodiny 1 a jejich interakčních partnerů
Milichovský, Jan
Cytochromy P450 jsou rozsáhlou skupinou proteinů metabolizujících široké množství substrátů. Řada z nich se významně podílí na metabolismu léčiv či jiných xenobiotik včetně řady chemických karcinogenů. Hemoprotein cytochrom b5 je jedno-elektronový přenašeč elektronů spolupracující s NADPH:cytochrom P450 reduktasou a NADH:cytochrom b5reduktasou 3, který je spjatý s metabolismem zprostředkovaným cytochromy P450. Cytochrom b5 je schopen prostřednictvím modulace aktivity cytochromů P450 ovlivňovat metabolismus řady látek. Cílem disertační práce bylo využít místně cílenou mutagenezi cytochromů P450 rodiny 1 k lepšímu porozumění mechanismu jejich nitroreduktasové aktivity. Dále byla studována interakce cytochromu b5 s cytochromy P450 podrodiny 1A pomocí místně cílené mutageneze jejich předpokládaného kontaktního rozhraní. V rámci práce byly také, za použití kombinace experimentu a teoretických přístupů, studovány rozdíly v redukci lidských cytochromů P450 v intaktních bakteriálních buňkách během jejich heterologní exprese. Z výsledků vyplývá, že nitroreduktasová aktivita CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 je zprostředkována hydroxylovou skupinou v aktivním místě a jejím zavedením lze u CYP1B1 artificiálně vyvolat nitroreduktasovou aktivitu. Pomocí mutageneze byly také identifikovány aminokyseliny, které se...
|
host ::
RSS.